Lehrinhalte des Teilgebietes "Kristallographische Methoden in der Biomolekularen Strukturaufklaerung" im Schwerpunktsfach Strukturbiologie.

Vortragender : Univ. Doz. (A.o.Univ.Prof.) Mag. Dr. Bernhard Rupp

Einfuehrung in die Biomolekulare Kristallographie

Ziel der Lehrveranstaltung : Einfuehrung in die Methodik und Anwendung moderner kristallographischer Strukturaufklaerungsverfahren. unter besonderer Beruecksichtigung des Zusammenhanges zwischen zugrundeliegenden biologischen Fragestellungen und einer entsprechender Planung der Protein-Reinigung, Charakterisierung, Kristallisation, erster Datensammlung und der Interpretation der Resultate einer Strukturermittlung. Ziel ser Lehrveranstaltung ist, einen entsprechend vorgebildeten Benutzer der Methode heranzubilden, der die Expertise eines Kristallographen optimal fuer seine eigene Forschung heranziehen kann.Vertiefung der Kenntnisse durch praktische Anwendung in Auswertung experimenteller oder simulierter Daten, Web-Tutorials. See www-structure.llnl.gov (oder European mirror site fuer schnelleren Transfer).

Format der Lehrveranstaltung : 2-stuendige Vorlesung, Blockveranstaltung, Web-unterstuetzt.

Einleitung

• Warum Kristallographie - Moeglichkeiten und Grenzen der Methode sowie aktuelle Beispiele fuer structure derived molecular mechanisms
• Befragung der Studenten ueber Background und entsprechende Gewichtung (siehe Punkt 5 oben)
• Anleitung zur Arbeit mit Web-tutorial

Proteine : Eigenschaften, Isolierung und Charakterisierung

• Ueberblick ueber Aufbau und Chemische Eigenschaften von Proteinen (Wiederholung mit Betonung auf Ansprueche der Proteinkristallographie)
• Expressionsysteme und Labelling von Proteinen. Selenomethionine Expression. Fusion-Proteins and Tags, reporter systems, inteins 
• Purification. His-tags, S-Tags. Accelerated Protocol Development mit Perfusion Chromatography.
• Characterisierung. Gels, Dynamische Lichtstreuung, Circulardichroismus und ihre Interpretation mit besondere Beruecksichtigung der Ansprueche der Kristallographie.    

Proteinkristalle

• Proteinloeslichkeit. Einfluss von Salzen, Organischen Faellungsmitteln, pH, Temperatur. Solvent content and Matthews-Coefficient.
• Binodal und Spinodalbereich der Entmischung. Thermodymanische vs. Kinetische Parameter.
• Methoden der Proteinkristallzucht
  • Batch Techniques
  • Vapour Diffusion
  • Dialysis
  • Gel Techniques and Microgravity
• Morphologische und optische Analyse von Proteinkristallen. Birefringence.
• Scrreening Methods. Sparse Martix, Factorial, and Random Screening Protocols.
• Optimization Techniques.

Kristallsymmetrie

• Einfuehrung in Kristallsymmetrie. Packungsmuster in Proteinkristallen
• Raumgruppen. Nichtzentrosymmetrische und Polare Gruppen.
• Nicht-kristallographische Symmetrie.

Grundlagen der Streutheorie

• Beugung von Roentgenstrahlen am Kristall. Equivalenz von Laue und Bragg-Gleichung.
• Das Reziproke Gitter und die Ewald-Kugel.
• Intensitaet gebeugter Roentgenstrahlen  Atomarer Streufaktor, Streugleichung und Strukturfaktor.
• Vektorrepresentation des Komplexen Strukturfaktors.Wiederholung elementarer Vektoralgebra.
• Anomale Dispersion.

Experimentelle Aspekte

• Experimental Setup. Roentgenquellen. Characteristische Wellenlaenge. Synchrotonstahlung. Moderne Detektoren.
• Cryocrystallography. Temperaturefactor vs. Static Disorder.
• Indizierung und Raumgruppenbestimmung.
• Datensammlungsstrategien. Friedel Pairs. Anomale Datensaetze.
• Datenreduktion und Skalierung

Einfuehrung in das Phasenproblem, Fouriertransformation und Phasenbestimmung

• Formulierung des Phasenproblems.
• Rekonstruktion der Elektronendichte mittels Fouriertransformation.
• Phasing Techniques : MIR, MAD and MR
• Einfache Elekrtonendichtekarten und Model Building

Strukturverfeinerung und Verifikation

• Minimisierungstechniken.
• R-Value, R-free, basic Crossvalidation.
• Geometrische und chemische Plausibilitaet. Ramachandran Plot. PROCHEK and WHAT-CHECK.
• Strukturdatenbanken, PDB.
• Aktuelle Beispiele fuer Strukturbestimmungen. Strukturmotive und Global Folds.

Uebungen zur Biomolekularen Kristallographie

Ziel der Lehrveranstaltung : Uebungen zu Vorlesung, Vertiefung der Kenntnisse durch praktische Anwendung. Kristallisationsexperimente, Auswertung experimenteller oder simulierter Daten, Web-Tutorials. See www-structure.llnl.gov (oder den European mirror site fuer schnelleren Transfer).

Format der Lehrveranstaltung : 1-stuendige Uebungen, Blockveranstaltung im Anschluss and Vorlesung "Einfuehrng in die Biomolekulare Kristallographie, Web-unterstuetzt .

Vorgeschrittene Methoden der Strukuraufklaerung in der Biomolekularen Kristallographie

Ziel der Lehrveranstaltung : Vorgeschrittene Methoden kristallographischer Strukturaufklaerungsverfahren. Erweiterung der Kenntinisse ueber Planung einer Strukurermittlung bis zu modernen Methoden der Phasenbestimmung, Model building, Refinement and Structure Validation. Das Ziel ist vorgebildete Biowissenschaftler zu kompetenten Benutzern der Methode heranzubilden, die selbststaendig den Gang einer Strukturermittlung skizzieren koennen und faehig sid, die Ergebnisse zur Planung weiterer Experimente innerhalb ihrer Strukturstudien heranzuziehen.

Format der Lehrveranstaltung : 2-stuendige Vorlesung, Blockveranstaltung, Web-unterstuetzt.

Einleitung

• Wiederholung der Schluesselpunkte aus Einfuehrungsvorlesung anhand des Web-Tutorials.
• Positver Abschluss des Repetitoriums ist Vorraussetzung fuer Teilnahme.

Advanced Methods in Protein Purification, Characterization and Crystallization

• Non-Eucariotic Expressionsystems.
• Modification of proteins for structural engineering.

Spezialfaelle der Proteinkristallisation und 2d Kristalle

• Membrane Proteins and Lipid Phases
• Automated crystallization and analysis procedures
• 2-dimensional crystals
• X-ray and Neutron Small Angle Scattering

Phasenproblem und Fouriertransformation.

• Widerholung : Formulierung des Phasenproblems.
• Rekonstruktion der Elektronendichte mittels Fouriertransformation.
• Spezielle Formen der Elektronendichtekarten. Omit, Sim weighting, SigmaA, and Maximum Likelihood Maps

Methoden zur Experimentellen Phasenbestimmung

• Ueberblick und Bedeutung der Phasenqualitaet. Model Bias.
• Multiple Isomorphous Replacement.Heavy Metal Derivatives.
• Patterson Maps. Interpretation und Loesung mittles Korrelationsmethoden, Superposition Search und Direkten Methoden. Refinement of Heavy Atom Positions.
• Anomale Dispersionstechniken. MAD.
• Molecular Replacement. Pitfalls and Complications.
• Kombinierte Methoden, SIRAS, MIRAS

Phasenverfeinerung und Model Building

• Verbesserung der initialen Phasen. Solvent Flattening, Density Modification, Symmetry Averaging.
• Model Building. Real Space Fitting. Errors in early Models.
• Phase combination. Phase extension. Minimierung von Model Bias.
• Automatische Modelbuiding and Refinement Procedures. ARP and WARP.

Strukturverfeinerung

• Minimisierungstechniken. Least Squares, Conjucated Gradeint, Maximum Likelihood. Reziproke vs. Direkte Methoden. Patterson Correlaion Refinement. Data-to-Parameter Ratios.
• Skalierung Experimenteller und Berechneter Daten. Wilson Plot und Intensitaetsstatistik.
• Rigid Body Refinement. B-factor refinement. PC correlation refinement. Moleculardynamik mit X-PLOR.
• Verfeinerung bei hoher Aufloesung : Multiple Konformationen, Wasserstruktur, Anisotropes Temperaturfaktor refinement.
• R-Value, R-free, Crossvalidation und festgefahrene Verfeinerungen. 

Strukurverifikation

• Geometrische und chemische Plausibilitaet. Ramachandran Plot. PROCHEK and WHAT-CHECK.
• Pitfalls of using validation programs withut reference to electron density
• Analyse von RMSD, B-faktor und Wasserstruktur. Potential surfaces.
• Flexibilitaet in Proteinstrukturen. Vergleich mit NMR.
• Strukturdatenbanken, PDB.

Anwendung von Strukturinformation

• Beispiele fuer die iterative Verfeinerung der Biologischen Fragestellung basierend auf neuer Strukturinformation. Aktuelle Beispiele.
• Truncation and re-engineering of proteins. ApoE Lipoproteine. Core regions of proteins.
• Search for a Binding Site : Gangliosid-Bindung im Tetanus Neurotoxin. Komplexe - Bildung, Kristallisation und Strukturaufklaerung.
• Ein Antibody als model fuer Rezeptor-Bindung : 2E8 Fab to ApoE LDL receptor binding region.
• The Breast Cancer Gene C-Terminal Region. Optimisation of growth and a tricky spacegroup.  

Ausgewahlte Probleme der Biomolekularen Kristallographie

Format der Lehrveranstaltung : Seminar, 1-stuendig

Voraussetzungen : Grundkenntnisse in der Proteinkristallographie, Einfuehrung in die Biomolekulare Kristallographie, Vorgeschrittene Methoden der Strukuraufklaerung in der Biomolekularen Kristallographie, oder persoenliche Anmeldung.

Beispiele fuer komplette, schwierige Strukturaufklaerungen aus dem Laboratorium der Vortragenden. Probleme wechseln laufend und representieren den neuesten Stand der Forschung. Journal Club possible.